TINCION GRAM.

El método de tincion diferencial más importante usado en bacteriología es la tincion de Gram, llamada así en honor al Dr. Hans Christian Gram. Este método divide las bacterias en dos grandes grupos, las Gram-negativas y las Gram-positivas. Esto es esencial para la clasificación y diferenciación de microorganismos. La reacción a la tinción de Gram está basada en la diferencia en la composición química de la pared celular bacteriana. Las bacterias Grampositivas tienen una gruesa capa de peptidoglicano o mureína, mientras que esta capa es más fina en las Gram-negativas y está rodeada por una bicapa lipídica externa. El Peptidoglicano es un polisacárido formado por dos subunidades químicas, N-acetilglucosamina y acido Nacetilmurámico.

a.       Colorante Cristal violeta

  Pesar 2 gramos de cristal violeta, mezclarlo con 20 ml de etanol agitar, y agregarle con mucho cuidado 0.8 g de oxalato de amonio y aforar con agua destilada,  en un matraz de 100 ml, mezclar  y guardar en un frasco color ámbar y  etiquetar.

b.       Violeta de Genciana

Pesar 0.5 gramos de cristal violeta de genciana  y aforar con agua destilada 100 ml, y guardar en un frasco color ámbar y etiquetar.

c.       Solución Lugol

Pesar 10 gramos de yoduro de potasio, y colocarlo en el matraz, medir 20 ml de agua destilada añadirla y agitar, pesar 5 gramos de yodo metálico y depositarlo a esta mezcla y aforar hasta 100 ml con Etanol o alcohol de 96° y guardar en un frasco color ámbar y etiquetar.

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d.       Solución alcohol –cetona   Preparación 1:2  la  que el profesor indique

Medir  Un volumen de Acetona  por dos volúmenes de Etanol de 95° y guardar en un frasco color ámbar y etiquetar.

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e.       Colorante Safranina

Pesar 0.5 gramos de  safranina, disolver la safranina poco a poco en 20 ml de agua destilada y aforar a 100 ml y guardar en un frasco color ámbar y etiquetar.

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f.        Preparación de la fenolftaleína .

La disolución de la fenolftaleína se puede preparar en forma sencilla de la siguiente  manera.

Pesar 1 gramo de fenolftaleína y disolverlo  en 600 ml de etanol, y añadiendo agua hasta completar un volumen de un litro (el volumen te lo indicará  tu profesor(a) guardar en un frasco color ámbar y etiquetar.

TÉCNCA DE TINCION GRAM.

FROTIS.

1.- Se toma una pequeña muestra con el asa de platino.

2.- Se fija el frotis flameando suavemente el portaobjetos por la llama del mechero.

3.- Se cubre el frotis con colorante.

4.- Lavar el preparado con agua destilada o corriente.

5.- Secar suavemente con papel absorbente.

6.- Se observa en el microscopio, enfocando en primer lugar con el objetivo del menor aumento y luego con el de mayor aumento, utilizando aceite de inmersión.

7.- Dibujar lo observado y registrar la forma de la célula y el tipo de agrupación que ésta presenta.

TINCION.

1.- Cubrir el frotis con 2 gotas de cristal violeta de 30 segundos a 1 minuto

2.- Lavar el fotis con agua de forma cuidadosa para eliminar el exceso de colorante.

3.- Cubrir el preparado con 2 gotas de lugol durante 30 segundos.

4.- Lavar el frotis cuidadosamente con agua.

5.- Cubrir el frotis con alcohol un 95% durante 1 minuto, procura inclinar el portaobjeto y aplicar gota a gota dejando que escurra hasta que no fluya mas la tintura.

6.- Lavar el frotis con agua inmediatamente.

7.- Cubrir el frotis con safranina 2 gotas aprox. durante 30 segundos.

8.- Lavar nuevamente con agua.

9.- Secar suavemente con toalla absorbente y dejar secar al aire.

10.- Observar el frotis en el microscopio, enfocando con el objetivo de bajo objeto hasta llegar al de inmersión.

11.- Dibujar y registrar las observaciones.

Resumen de los pasos de la Tincion de Gram.

                         
Bacilos Gram Positivos.

 

 Bacilos Gram Negativos.

Fundamento de la tinción de Gram.

• Los lavados con agua tienen el objetivo de arrastrar mecánicamente el exceso de colorante y quitar el alcohol-acetona.
• El colorante cristal violeta es de naturaleza básica y por lo tanto tiene afinidad por sustancias cargadas negativamente como la pared celular de cualquier bacteria.por lo que bacterias Gram positivas y Gram negativas son teñidas de color violeta.
• Un mordiente es una sustancia que aumenta la fijación de algún colorante sobre una superficie determinada, en este caso el cristal violeta aumenta su fijación a la pared célular bacteriana usando de mordiente al lugol, en la pared bacteriana el lugol forma un complejo con el cristal violeta insoluble en agua lo que evita que se disuelva y se pierda el colorante durante el enjuague.Ya sabemos que la pared de los Gram positivos son ricos en ácidos teicoicos no saturados estos muestran gran afinidad por los agentes oxidantes, todos los mordientes por ejemplo el lugol son agentes oxidantes y su efecto en general consiste en dar un caracter mas ácidez de los ácidos teicoicos lo que aumenta la afinidad de estos por el colorante básico cristal violeta.
• La mezcla de alcohol-acetona es un disolvente orgánico que decolora la pared bacteriana disolviendo el complejo cristal violeta-lugol, esta decoloración no afecta a las bacterias Gram positivas, hay varias explicaciones al respecto, les menciono las dos más aceptadas.
• La safranina es un colorante catiónico que tiñe las paredes bacterianas ya que estas tienen compuestos cargados negativamente, por consiguiente las bacterias Gram negativas se tiñen de color rosa, sin embargo las bacterias Gram positivas no se tiñen debido  a que su pared célular esta saturada del colorante cristal violeta y esto no permite la entrada de la safranina.

Factores que considerar en la tinción de Gram.

• No se debe sobrepasar los tiempos de tinción y decoloración.
• Los cultivos viejos hacen que las bacterias Gram positivas se tiñan parcial o totalmente de color rosa.
• Hay que tomar en cuenta que el agua usada en el frotis se encuentre en el rango de Ph 7-7.8 ya que: Los gram positivos pueden hacerse gram negativos al aumentar la acidez. Los gram negativos pueden hacerse gram positivos al aumentar la alcalinidad.