Los constituyentes habituales
de los medios de cultivo son:
1. Agar. Se utiliza como agente solidificante. Es un
polisacárido que se obtiene de ciertas algas marinas. Las bacterias no son
capaces de degradarlo.
2. Azúcares. Son una fuente de carbono para los
microorganismos. Los más empleados son la glucosa, la lactosa y la sacarosa.
3. Extractos. Son preparados de ciertos órganos o tejidos
animales o vegetales obtenidos con agua y calor. Ej.: extracto de carne, de
levadura, de malta, etc.
4. Peptonas. Son proteínas hidrolizadas, se obtienen por
digestión química o enzimática de proteínas animales o vegetales.
5. Fluidos corporales. Sangre completa, sangre desfibrinada, plasma o
suero sanguíneo son añadidos a los medios empleados para el cultivo de algunos
microorganismos patógenos.
6. Sistemas amortiguadores. Son sales que se añaden al medio para mantener el
pH dentro del rango óptimo del crecimiento bacteriano. Ej.: fosfatos bisódicos
o bipotásicos.
7. Indicadores de pH. Son indicadores ácido-base que se añaden para
detectar cambios de pH en el medio.
8. Agentes reductores. Sustancias que se añaden al medio para crear las
condiciones que permitan el desarrollo de los gérmenes microaerófilos o
anaerobios. Ej.: cisteína y tioglicolato.
9. Agentes selectivos. Sustancias como el cristal violeta, las sales
biliares etc. que a determinadas concentraciones en el medio actúan como
agentes selectivos frente a determinados microorganismos.
Sembrar es colocar una muestra de inóculo, en un
medio de cultivo para obtener el crecimiento de los microorganismos. Para ello
se extiende la muestra sobre caja de Petri, que contiene un gel (Agar) al que
se han añadido las substancias que necesitan los microorganismos para crecer. A
esto lo llamamos medio de cultivo. A veces se añaden otras clases de
sustancias; por ejemplo, para impedir el crecimiento de otras bacterias que
podrían contaminar el cultivo.
A
continuación se procede a la "incubación" del medio ya sembrado. En
cada caso se hace en condiciones particulares de presión de oxígeno,
temperatura, agitación, duración, etc. Aprendimos que muchas de las bacterias
patógenas crecen bien a temperaturas cercanas a los 37ºC habituales de nuestro
organismo.
Si el
cultivo bacteriano tiene éxito, crecerán "colonias" de bacterias en
el medio de cultivo. Estas colonias tienen características de color, forma,
tamaño etc. propias de cada bacteria y esto nos ayuda a identificarlas. También
se puede someter a las bacterias de las colonias a pruebas bioquímicas o de
otro tipo para lograr su identificación. Algunas bacterias son muy difíciles de
cultivar, otras tardan mucho tiempo en crecer y algunas, finalmente, no se han
conseguido cultivar.
Procedimiento:
Primeramente se desinfecta el área de trabajo con fenol al 5% se espera que se evapore y se procede a encender el mechero de
preferencia dos.
- Preparación de medios de
cultivo sólidos.
- Leer las instrucciones del
fabricante para cada medio de cultivo y pesar la cantidad necesaria según el volumen requerido.
- Con una probeta medir el
volumen requerido y verter este en un matraz Erlenmeyer previamente
esterilizado.
- Colocar el medio en un
matraz Erlenmeyer, que contenga el agua destilada en el volumen requerido,
agitar con una varilla de vidrio en forma suave y calentar en la parrilla
a fuego lento hasta la ebullición, para disolver completamente el Agar.
Usar un guantelete de trapo para manipular materiales calientes.
Nota: En el último paso se
debe tener cuidado ya que el recipiente se calienta en exceso y el producto
tiende a hervir y proyectarse, lo cual puede producir serias quemaduras.
- El Agar disuelto hace
transparente al medio que originalmente estaba turbio. Puede utilizarse un
baño maría para aumentar la solubilidad.
- Si se va a envasar en
cajas de Petri, es necesario conservar el medio en un matraz y esterilizarlo
a 121°C durante 15 minutos en la autoclave u olla de presión.
- Al terminar, es
conveniente mantener el mechero encendido para formar un área de
esterilidad al momento del vaciado en las cajas de Petri
aproximadamente de 15 a 20 ml
de Agar por caja procurando
que no se forman burbujas; flamear el medio de
cultivo sobre la superficie de la caja de Petri y de manera rápida. Se procede a tapar
la caja inmediatamente.
- Si se desea que el Agar o
medio quede en tubos, entonces se esterilizará el Agar directamente en ellos a 121°C durante 15
minutos tapados con algodón, gasa y papel estraza. Si desea que
solidifiquen inclinados, colocarlos en una superficie lisa inclinándolos
en un ángulo de 20 a 30°, sobre una varilla de vidrio.
- En caso de que
se preparara el Agar base Sangre es necesario Adicionar en condiciones
de asepsia sangre desfibrinada estéril en concentración final de 15%.
Después de la esterilización del Agar base Mezclar cuidadosamente y poner
en cajas Petri estériles
B.
Vaciado en cajas Petri
1)
No destapar las cajas de
Petri, sino hasta el momento que vayan a ser utilizadas. Es conveniente
colocarse, un cubre bocas la persona que va a realizar el vaciado y evitar
hablar en todo momento para no contaminar el medio de cultivo.
2)
Es conveniente mantener el
mechero encendido y trabajar cerca
del área estéril al momento del
vaciado en las cajas de Petri. Levantar la tapadera de la caja Petri con la
mano izquierda, sin soltarla y sin
retirarla demasiado de la base de la
misma caja mientras que con la mano derecha tomar el matraz que
contiene el medio de cultivo y realizar el vaciado de aproximadamente 15 a 20
ml de Agar por caja procurando que no se forman burbujas se procede a tapar la
caja inmediatamente.
3)
Si se forman burbujas,
tomar el mechero, flamear el medio de cultivo sobre la superficie de la caja de
Petri y de manera rápida. Se procede a
tapar la caja en forma inmediata.
4)
Esperar a que el medio solidifique.
5)
Se rotulan los medios de
cultivo, anotando la fecha y con iniciales el tipo de medio de cultivo.
6)
Si las placas no se van a
utilizar el mismo día se sujetan con cinta y se
colocan en el refrigerador de manera invertida para evitar que el vapor condensado caiga
sobre el medio de cultivo y lo pueda contaminar.
7)
Cuando se vayan a utilizar los medios de cultivo preparados,
será necesario secar las placas invertidas en estufa a 37 °C. Antes de realizar
el sembrado de microorganismos.
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