Durante el transcurso del curso se logró aprender a realizar algunos de los métodos que existen para cultivar bacterias y de esta manera observar sus características tanto macroscópicas como microscópicas e interpretación de las mismas, con lo que se observó que para cada bacteria existen características diferentes que son las que las identifican y diferencian de otras bacterias, por lo que de esta manera se le puede llegar a identificar con su correcta siembra y observación para análisis posteriores o simplemente para la identificación de una bacteria en algún medio u organismo.
lunes, 8 de diciembre de 2014
LOGROS OBTENIDOS.
ESTAFILOCOCO MEDIO 110
Es un medio selectivo para el aislamiento y diferenciación presuntiva de estafilococos, en base a la producción de pigmentos, la fermentación de manitol y la hidrólisis de gelatina, a partir de alimentos y otras muestras.
Fundamento
Staphylococcus aureus es un microorganismo que puede causar intoxicación alimentaria, y para su aislamiento, pueden usarse distintos medios sólidos selectivos: Baird Parker Medio (B02-141-05/06), Manitol Salado Agar (B02-118-05/06), o Estafilococo Medio 110 (B02-105-05/06).
En el medio de cultivo, el extracto de levadura y la tripteína aportan los nutrientes para el desarrollo de microorganismos. La gelatina es el sustrato de la enzima gelatinasa. La lactosa y el manitol son los hidratos de carbono fermentables. El cloruro de sodio, se encuentra en alta concentración, para inhibir el desarrollo de la flora acompañante excepto Staphylococcus spp., lográndose así un medio selectivo para el desarrollo de estos microorganismos.
Las ventajas de este medio por sobre los otros mencionados anteriormente, es que permite, en la misma placa,
obtener pruebas de identificación presuntiva de especie como ser: desarrollo de pigmentos, fermentación de manitol e hidrólisis de la gelatina.
Fórmula (en gramos por litro)
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Instrucciones
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Extracto de levadura
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2.5
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Suspender 149 g del medio en un litro de agua destilada. Reposar 5 minutos y mezclar calentando a ebullición durante 1 o 2 minutos. Esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 121°C. Verter en placas y mezclar para dispersar el precipitado.
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Tripteína
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10.0
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Gelatina
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30.0
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Lactosa
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2.0
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D-Manitol
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10.0
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Cloruro de sodio
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75.0
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Fosfato dipotásico
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5.0
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Agar
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15.0
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pH final: 7.0 ± 0.2
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Siembra
Directa, en superficie, por estriado o por extensión.
Incubación
Durante 48 horas, a 35-37 °C, en aerobiosis.
Resultados
Observar las características de las colonias y realizar las pruebas de identificación de microorganismos.
1-Fermentación de manitol: agregar unas gotas de púrpura de bromocresol a las zonas donde se encuentran las colonias sospechosas y en una zona de la placa donde no hay desarrollo bacteriano. Comparar el color desarrollado entre estas dos zonas.
Prueba positiva: cambio de color del indicador del medio en la zona de crecimiento bacteriano. El medio sin desarrollo de microorganismos permanece sin cambio.
Prueba negativa: no hay diferencias de color entre las zonas de crecimiento bacteriano y la zona sin inocular.
2-Hidrólisis de la gelatina: cubrir la placa 5 ml de una solución saturada de sulfato de amonio y colocar en estufa, a 35-37 ºC, en aerobiosis durante 10 minutos.
Positiva: halo transparente alrededor de las colonias.
Negativa: ausencia de halo transparente alrededor de las colonias.
Microorganismo
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Pigmento
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Fermentación de manitol
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Hidrólisis de la gelatina
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Prueba de la coagulasa
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S. aureus ATCC 25923
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+
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+
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+
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+
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S. aureus ATCC 6538
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+
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+
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+
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+
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S. epidermidis ATCC 14990
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-
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-
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+
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-
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Notas:
“Realización de la Prueba de la coagulasa”: agregar a 0,5 ml de plasma heparinizado (preferentemente de conejo o humano), igual volumen de un cultivo de 24 horas en Cerebro Corazón Infusión (B02-146-05/06), obtenido a partir de las colonias sospechosas. Incubar a 35-37 °C durante 2 a 3 horas, en aerobiosis. Los estafilococos coagulasa positivos forman un coágulo antes de ese período.
Limitaciones
-Algunas cepas de Enterococcus faecalis, fermentadoras de manitol, pueden desarrollar en este medio.
-Para realizar la prueba de la coagulasa, se aconseja subcultivar las colonias sospechosas en medios sólidos o líquidos no selectivos, por ejemplo: Agar Nutritivo, Infusión Cerebro Corazón, Triptosa Fosfato Caldo, debido a que si se realiza directamente de este medio de cultivo, puede afectarse la detección por el alto contenido de cloruro de sodio.
Características del medio
Medio preparado: ámbar claro, opalescente con precipitado.
Almacenamiento
Medio deshidratado: a 10-35 ºC.
Medio preparado: a 2-8 ºC.
Presentación
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x 100g :Código: B02-105-05
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x 500g :Código: B02-105-06
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PRÁTICA DEL ESTAFILOCOCO MEDIO 110
1.- Preparar la muestra a estudiar (cebolla y cilantro de la cafetería).
2.- Triturar la muestra en un mortero, le colocamos agua destilada.
3.- Filtrar con ayuda de una gasa y un embudo y se coloco en un tubo de ensaye.
4.- El medio ya se había preparado, como se había hecho con los medios anteriormente.
5.- Después se inoculo la muestra en el medio mediante estrías por agotamiento en toda la caja.
Después de haber dejado incubando nuestro material, al observarlo, notamos que habían pequeñas colonias, de color blanco incoloro, que tenían pequeñísimos halos en sus orillas, tenían una elevación convexa, y tenían forma circular. Por lo que podríamos deducir que la muestra fue negativa en la hidrólisis de la gelatina.
También le realizamos la prueba de coagulasa y catalasa.
COAGULASA
1.- Tomamos plasma de sangre que ya había sido centrifugada, y posteriormente inoculamos la bacteria ahí con ayuda del asa, posteriormente se llevo al baño maría, para después obtener la muestra.
CATALASA
1.- Colocamos una muestra de la colonia en un portaobjeto y después le agregamos una gota de agua oxigenada para ver si era positiva.
AGAR MAC CONKEY.
Uso
Este medio se utiliza para el aislamiento de bacilos Gram negativos
de fácil desarrollo, aerobios y anaerobios facultativos a partir
de muestras clínicas, aguas y alimentos. Todas las especies de la
familia Enterobacteriaceae desarrollan en el mismo.
Su fórmula cumple con los requerimientos de la Armonización de
Farmacopeas Europea, Japonesa y de los Estados Unidos de Norteamérica
(EP, JP y USP respectivamente).
Fundamento
En el medio de cultivo, las peptonas, aportan los nutrientes necesarios
para el desarrollo bacteriano, la lactosa es el hidrato de
carbono fermentable, y la mezcla de sales biliares y el cristal violeta
son los agentes selectivos que inhiben el desarrollo de gran parte
de la flora Gram positiva. El agar es el agente solidificante.
Por fermentación de la lactosa, disminuye el pH alrededor de la
colonia. Esto produce un viraje del color del indicador de pH (rojo
neutro), la absorción en las colonias, y la precipitación de las sales
biliares.
Los microorganismos no fermentadores de lactosa producen colonias
incoloras.
Contenido y composición
Código B0211405: envase x 100 g.
Código B0211406: envase x 500 g.
FÓRMULA (en gramos por litro)
Peptona de carne............................................................... .......................1.5.
Peptona de gelatina...................................................................................17.0.
Tripteína ....................................................................................................1.5.
Lactosa.......................................................................................................10.0.
Mezcla de sales biliares Nº3................................................................. .....1.5.
Cloruro de sodio..........................................................................................5.0.
Rojo neutro..................................................................................................0.03.
Cristal violeta......................................................................... .....................0.001
Agar.............................................................................................................13.5.
pH final: 7.1 ± 0.2
Instrucciones
Suspender 50 g del polvo en 1 litro de agua purificada. Reposar 5
minutos. Calentar con agitación frecuente y llevar a ebullición 1 a
2 minutos hasta disolver completamente. Distribuir en recipientes
apropiados y esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos.
Características del producto
Medio de cultivo deshidratado: color beige rosado, homogéneo, libre
deslizamiento.
Medio de cultivo preparado: color rojizo púrpura.
Almacenamiento
Medio de cultivo deshidratado a 10-35 ºC.
Medio de cultivo preparado a 2-8 ºC.
Procedimiento
-Siembra
En superficie: inocular directamente la muestra por estría.
En profundidad: inocular una alícuota de la muestra directa o de su
dilución. Verter un volumen del medio de cultivo fundido y enfriado
a 40-45°C. Homogeneizar mediante movimientos de vaivén y rotación.
Dejar solidificar.
-Incubación
En aerobiosis, a 35-37 ºC durante 18-48 horas.
Interpretación de los resultados
Microorganismos fermentadores de lactosa: colonias rosadasrojizas.
Puede observarse halo de precipitación biliar.
Microorganismos no fermentadores de lactosa: colonias del
color del medio, incoloras.
E.M.B.
Este medio (también denominado E.A.M.) es utilizado para el aislamiento selectivo de bacilos Gram negativos de rápido desarrollo y escasas exigencias nutricionales. Permite el desarrollo de todas las especies de la familia Enterobacteriaceae.
Fundamento
Este medio combina las fórmulas de Holt-Harris y Teague con la de Levine, para obtener un mejor rendimiento en el aislamiento selectivo de enterobacterias y otras especies de bacilos Gram negativos. La diferenciación entre organismos capaces de utilizar la lactosa y/o sacarosa, y aquellos que son incapaces de hacerlo, está dada por los indicadores eosina y azul de metileno; éstos ejercen un efecto inhibitorio sobre muchas bacterias Gram positivas. Muchas cepas de Escherichia coli y Citrobacter spp. presentan un característico brillo metálico. Las cepas que utilizan la lactosa poseen centro oscuro con periferia azulada o rosada, mientras que las que no lo hacen son incoloras. Este medio permite el crecimiento de Candida spp. como colonias rosadas y puntiformes; la siembra en profundidad permite el desarrollo de clamidosporas en C. albicans. Enterococcus spp. crece en este medio como colonias puntiformes y transparentes, mientras que Acinetobacter spp. y otras bacterias oxidativas pueden dar colonias de color azul lavanda; esto puede ocurrir aunque las cepas no sean capaces de acidificar a partir de lactosa al 0.5% y ello se debe a la incorporación de azul de metileno a sus membranas. En este medio se obtiene además, un buen desarrollo de especies de Salmonella y Shigella.
Fórmula (en gramos por litro)
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Instrucciones
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Peptona
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10.0
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Suspender 36 g del polvo en un litro de agua destilada. Reposar 5 minutos; mezclar, calentando a ebullición durante 1 o 2 minutos hasta su disolución. Esterilizar en autoclave a no más de 121°C durante 15 minutos. Enfriar a 45°C y distribuir agitando suavemente.
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Lactosa
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5.0
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Sacarosa
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5.0
| |
Fosfato dipotásico
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2.0
| |
Agar
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13.5
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Eosina
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0.4
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Azul de metileno
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0.065
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pH final: 7.2 ± 0.2
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Siembra
En superficie, por estriado a partir de un inóculo poco denso, para obtener colonias aisladas.
En profundidad, para favorecer el desarrollo de clamidosporas.
Incubación
De 24 a 48 horas a 35-37 °C, en aerobiosis.
Procedimiento
1.- Pesar 3.6 gramos del medio
2.- Se coloca en el matraz y disolver en 100ml de agua destilada, agitar.
3.- Colocar en la parrilla y dejar que hierva
4.- Una vez que hierva quitar inmediatamente de la parrilla.
5.- Posteriormente servir en cajas de petri y esperar a que se solidifique.
Resultados
Microorganismos
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Tipo de Colonia
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Escherichia coli ATCC 25922
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Verdosas con brillo metálico y centro negro azulado
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Klebsiella pneumoniae ATCC 700603
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Mucosas, rosa púrpura, confluentes
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Proteus mirabilis ATCC 43071
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Incoloras
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Enterococcus faecalis ATCC 29212
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Incoloras, pequeñas, puntiformes
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Shigella flexneri ATCC 12022
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Incoloras
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Salmonella typhimurium ATCC 14028
|
Incoloras
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Características de medio y colonias.
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Escherichia coli.
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Citrobacter ssp.
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C. Albicans Clamidosporas.
Salmonella, Shigella
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Enterococcus
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Acinetobacter
|
Lactosa.
|
+
|
+
|
-
|
-
| |
Sacarosa.
|
+
|
+
|
-
|
-
| |
Glucosa
|
+
|
+
| |||
Brillo metálico.
|
+
|
+
|
-
| ||
Centro grande y obscuro con periferia azulada o rosada.
|
+
|
+
|
-
|
-
|
-
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Colonias rosadas y puntiformes.
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-
|
-
|
+
|
-
|
.
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Colonias puntiformes y transparente.
|
-
|
-
|
-
|
+
|
-
|
Colonias de azul lavanda.
|
-
|
-
|
-
|
-
|
+
|
Siembra en profundidad.
|
+
|
+
|
+
| ||
Siembra en superficie.
|
+
|
+
|
-
|
-
|
-
|
Bacterias Gram -
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Características del medio:
Placas preparadas: color púrpura.
La esterilización del medio de cultivo reduce el azul de metileno al color naranja. El color púrpura se restaura por agitación. La presencia de un precipitado en el medio esterilizado es normal y no debe ser removido, ya que es parte esencial del mismo.
Almacenamiento:
Medio deshidratado: a 10-35 ºC.
Medio preparado: a 2-8 ºC.
Presentación
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x 100g :Código: B02-101-05
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x 500g :Código: B02-101-06
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6 x 50 ml: B04-101-84
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UREA.
Uso
Se emplea para la diferenciación de bacterias por medio de la utilización de la urea como única fuente de carbono.
Principio
La enzima ureasa hidroliza la urea en amoníaco y anhídrido carbónico, ante la variación de pH por la alcalinización, el indicador rojo de fenol, vira de amarillo claro a ligeramente rosado o rosa mexicano.
Se utiliza solamente para la detección de la actividad de la ureasa en especies del género Proteus que dan la prueba positiva después de una incubación de 8 h. Si los nutrientes suministrados por el extracto de levadura se consumen antes de que la bacteria muestre un crecimiento aceptable no podrá determinarse con exactitud su capacidad de hidrolizar la urea. Si un microorganismo es capaz de hidrolizar la urea, pero no de utilizar el amoníaco como fuente de nitrógeno, no se produce crecimiento y es posible observar un resultado falso negativo. No se recomienda para las bacterias con reacción de ureasa retardada. Sembrar el medio de cultivo con el cultivo puro de ensayo. Incubar 24 – 48 h a 35ºC. En ocasiones hasta 72 horas.
Se utiliza para la valoración de la producción de ureasa por algunas enterobacterias. Este medio contiene glucosa, peptona, urea y rojo de fenol. Las bacterias que producen ureasa a partir de la urea dan lugar al carbonato de amonio y el indicador se vuelve rojo púrpura. Obsérvese en la tabla de reacciones bioquímicas que solo el género Proteus da esta reacción positiva.
Fórmula (en gramos por litro)
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Instrucciones
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Tripteína
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1.0
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Suspender 24 g de polvo en 950 ml de agua destilada. Dejar reposar 2 minutos. Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos. Enfriar a 50°C y agregar 50 ml de una solución de urea al 40% previamente esterilizada por filtración o cloroformo. Fraccionar en tubos de hemólisis y solidificar en pico de flauta con fondo profundo.
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Glucosa
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1.0
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Cloruro de sodio
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5.0
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Fosfato monopotásico
|
2.0
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Rojo de fenol
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0.012
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Agar
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15.0
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pH final: 6.8 ± 0.2
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